Универсальность генетического кода позволяет осуществить перенос генов из одних организмов в другие независимо от эволюционной иерархичности. Такой направленный перенос генов позволяет получать формы с новыми свойствами в сжатые сроки и преодолевать эволюционные барьеры в отличие от классических методов гибридизации.
Метод биологической баллистики является довольно эффективным. Суть метода сводится к тому, что на частицы вольфрама (диаметр 0,6-1,2 мкм) напыляются ДНК векторы. Такая частица с иммобилизованной ДНК наносится на целлофановую подложку и помещается внутрь так называемой баллистической пушки.
Этот подход основан на том, что ДНК заключается в липосомы (способы получения липосом описаны ранее), а на следующем этапе обеспечивается слияние липосом с протопластами или захват протопластами путем эндоцитоза липосом, несущих ДНК.
В дальнейшем осуществляется культивирование и селекция протопластов, несущих чужеродную ДНК, используя те же методические подходы, которые используются и при других способах трансформации.
Техника микроинъекций ДНК в клетку была разработана в 1970 г. независимо А. Грассианом и Е.Г. Дьякумакосом. На первых этапах разработки метода были использованы клетки, имеющие большие размеры (ооциты). Метод основан на использовании стеклянных капилляров с диаметром кончика 0,5-10 мкм, с помощью которого осуществляют прямой перенос молекул или органелл в цитоплазму или ядро реципиентной клетки. Для этого реципиентную клетку иммобилизуют (связывают) с подложкой.
Использование электрических импульсов при трансформации клеток началось с 1985 г., когда Нейман и соавторы [Neuman Н., Yamada Y., 1985] показали, что электрические импульсы увеличивают частоту трансформации клеток мыши экзогенной ДНК. Этот метод был назван электропорацией. А позже этот метод начал использоваться и при трансформации протопластов.
Для оценки эффективности захвата реципиентности клетками они используют метод дотблот-гибридизации.
При непосредственном переносе ДНК (в форме вектора) в клетку необходимо решить две основные задачи: обеспечить защиту вектора от эндонуклеаз и захват вектора клеткой.
Использование векторов на основе плазмид агробактерий при трансформации растительных клеток уже позволили получить интересные практические и важные теоретические результаты.
Векторы на основе агробактерий продолжают совершенствоваться что, вероятно, позволит расширить области их применения.
Вместе с тем, этот подход при получении трансгенных растений имеет и серьезные ограничения.
Как уже отмечалось, растительный протопласт - клетка с удаленной клеточной стенкой. Культивируемые протопласты являются популяцией однотипных клеток, которые могут быть трансформированы. Термин «трансформация» означает введение чужеродной ДНК в клетку и это необязательно приводит к опухолевому фенотипу.
В экспериментах по трансформации векторами можно использовать не только побеги и каллус, но и отдельные клетки (протопласты) или малые гомогенные эксплантаты. Этот подход иногда называют методом совместного культивирования агробактерий с многочисленными популяциями дедифференцированных растительных клеток.
Для малых гомогенных эксплантатов характерно:
Методы генетической трансформации растений чаще всего сводятся к подбору эксплантатов, способных эффективно регенерировать побеги. Для этого подбирают эксплантат и комбинацию сред, способных обеспечить регенерацию растений путем органо- или эмбриогенеза. К сожалению, пока невозможно предсказать условия необходимые для эффективной регенерации побегов у разных видов. Не существует единых правил оптимизации питательных сред для регенерации и состав среды устанавливается только эмпирическим путем.